O nouă metodă de microscopie cu expansiune ar putea schimba modul în care cercetătorii studiază proteinele. Folosind un hidrogel special, oamenii de știință au reușit să mărească probele biologice de peste 1.000 de ori în fiecare direcție, ceea ce înseamnă o creștere de aproximativ un miliard de ori a volumului. Tehnica, denumită thousandfold expansion microscopy (1000ExM), poate transforma distanțele microscopice dintre aminoacizii unei proteine în separații suficient de mari pentru a fi observate cu un microscop optic convențional.
Descoperirea este importantă deoarece analiza structurii proteinelor la scară atomică a depins până acum în mare măsură de tehnici sofisticate precum microscopia electronică criogenică (cryo-EM) sau cristalografia cu raze X. 1000ExM propune o abordare radical diferită: în loc să facă microscopul mai performant, cercetătorii fac proba biologică mult mai mare.
De ce este atât de dificil să vedem proteinele?
Proteinele sunt molecule extrem de mici, formate din lanțuri de aminoacizi pliate în structuri tridimensionale complexe. Modul în care acești aminoacizi sunt aranjați determină funcția proteinei, iar chiar și modificări structurale minuscule pot avea consecințe biologice importante.
Problema este că dimensiunile acestor molecule se află mult sub limita rezoluției unui microscop optic obișnuit. Un microscop cu lumină vizibilă poate produce imagini spectaculoase ale celulelor, țesuturilor și organitelor, dar nu poate separa direct componentele individuale ale unei proteine.
Pentru a ajunge la asemenea detalii, cercetătorii folosesc metode specializate. Microscopia electronică criogenică, de exemplu, poate furniza informații structurale la rezoluții extrem de ridicate, dar necesită aparatură complexă, infrastructură costisitoare și proceduri sofisticate.
Microscopia cu expansiune pornește de la o idee aparent paradoxală: dacă obiectul este prea mic pentru microscop, atunci poate fi mărit fizic înainte de a fi observat. Tehnica nu mărește pur și simplu imaginea obținută de microscop. Ea modifică efectiv materialul biologic prin încorporarea componentelor sale într-o rețea polimerică ce poate fi umflată ulterior.
Un hidrogel care transformă nanometrul în micrometru
Noua metodă 1000ExM folosește o arhitectură formată din patru rețele polimerice interpenetrante. Cercetătorii au optimizat succesiv aceste rețele pentru a permite expansiunea probei la niveluri mult mai mari decât în metodele anterioare.
Principiul poate fi imaginat ca o versiune extremă a unui burete care se umflă atunci când absoarbe apă. Hidrogelul conține o rețea moleculară care poate absorbi cantități mari de apă și își poate mări considerabil dimensiunile.
În cazul 1000ExM, procesul este mult mai sofisticat. Proba este încorporată în hidrogel, iar componentele proteinei sunt ancorate în rețeaua polimerică. După o serie de etape chimice, structura este expandată succesiv.
În versiunea finală, cercetătorii au obținut o expansiune liniară de aproximativ 1.000 de ori. Diferența dintre expansiunea liniară și cea volumetrică este esențială: dacă fiecare dintre cele trei dimensiuni spațiale crește de 1.000 de ori, volumul crește de aproximativ 1.000 × 1.000 × 1.000, adică de un miliard de ori. Astfel, o distanță de ordinul nanometrilor poate fi transformată într-o distanță de ordinul micrometrilor, suficient de mare pentru a fi rezolvată prin microscopie optică.
Cum poate fi „întinsă” o proteină fără să-i fie distrusă structura?
Aceasta este una dintre cele mai importante provocări ale metodei. Dacă o proteină este pur și simplu întinsă sau deformată, informația despre structura sa originală se poate pierde. În 1000ExM, cercetătorii au urmărit să păstreze relațiile spațiale dintre componentele moleculei pe măsură ce aceasta este mărită.
Un element esențial este ancorarea lanțurilor laterale ale aminoacizilor în hidrogel. Ulterior, legăturile din scheletul proteic sunt clivate, iar reziduurile individuale pot fi îndepărtate unele de altele prin expansiunea succesivă a rețelei polimerice.
Cercetătorii au testat metoda pe proteine cu structuri cunoscute, inclusiv nanocorpi și GFP – proteina fluorescentă verde – precum și pe o peptidă bine caracterizată, numită mCLING. Rezultatele au indicat că informația structurală a fost menținută pe parcursul expansiunii.
Mai mult, analizele computaționale sugerează că metoda poate ajunge la o precizie subnanometrică, suficientă pentru a distinge reziduuri de aminoacizi aflate unul lângă altul.
Este, în esență, o schimbare de perspectivă: cercetătorii nu încearcă să construiască un microscop capabil să vadă mai mult, ci modifică proba astfel încât ceea ce vor să vadă să devină suficient de mare.
De la structura unei proteine la identificarea ei
Implicațiile sunt mai largi decât simpla obținere a unor imagini mai mari. Forma unei proteine este strâns legată de funcția sa. Dacă cercetătorii pot determina pozițiile spațiale ale aminoacizilor, aceste informații pot deveni o adevărată „semnătură moleculară” a proteinei.
Autorii studiului au folosit simulări pentru a testa dacă tiparele spațiale rezultate prin 1000ExM ar putea identifica proteine individuale. Analizele realizate asupra proteinelor din proteomul uman sugerează că informația geometrică a aminoacizilor ar putea fi suficientă pentru identificarea unică a majorității proteinelor.
Această posibilitate deschide perspectiva unei forme de identificare structurală a proteinelor, în care cercetătorii nu trebuie neapărat să izoleze fiecare proteină și să o analizeze separat.
În viitor, o asemenea abordare ar putea fi deosebit de interesantă pentru studiul celulelor, unde mii de proteine diferite interacționează simultan.
Poate înlocui microscopia electronică criogenică?
Nu încă. Este important de subliniat că rezultatele actuale provin dintr-un preprint, adică o lucrare care nu trecuse încă prin evaluarea completă inter pares la momentul raportării. În plus, demonstrația actuală a fost realizată în principal pe sisteme purificate. Autorii consideră că una dintre următoarele provocări majore este aplicarea tehnicii direct în celule și țesuturi intacte.
Există și alte dificultăți. O metodă care funcționează foarte bine pentru o proteină purificată trebuie să facă față unui mediu biologic mult mai complex atunci când este utilizată într-o celulă. Numeroase proteine, membrane, acizi nucleici și alte structuri pot interfera cu procesul de ancorare, clivare, colorare și expansiune.
Prin urmare, 1000ExM nu trebuie privită în prezent drept un înlocuitor al cryo-EM sau al altor metode de biologie structurală. Mai degrabă, ea reprezintă o nouă strategie complementară, care ar putea face anumite tipuri de investigații moleculare mult mai accesibile.
O posibilă democratizare a biologiei structurale
Poate cea mai interesantă consecință a tehnologiei este legată de accesibilitate. Microscopia optică fluorescentă este mult mai răspândită în laboratoarele de cercetare decât instrumentele de ultimă generație utilizate pentru determinarea structurilor moleculare. Dacă 1000ExM va putea fi adaptată pentru utilizarea în celule și țesuturi și dacă performanța sa va fi confirmată prin studii independente, ea ar putea permite unor laboratoare care nu dispun de echipamente extrem de costisitoare să studieze structuri moleculare cu o precizie fără precedent.
De aici apare și una dintre ideile centrale ale acestei cercetări: în loc să democratizăm accesul la microscoape din ce în ce mai sofisticate, putem transforma probele astfel încât acestea să poată fi analizate cu instrumente deja disponibile.
În acest sens, hidrogelul nu este doar un material care face o probă mai mare. El devine o verigă între lumea moleculară și instrumentele de observație convenționale.
O nouă direcție pentru microscopia moleculară
Performanța obținută de 1000ExM marchează o extindere spectaculoasă a conceptului de microscopie cu expansiune. Cercetătorii au demonstrat că o probă biologică poate fi mărită de peste 1.000 de ori în fiecare dimensiune, transformând o structură moleculară inaccesibilă microscopiei optice într-una care poate fi analizată la scară micrometrică.
Mai important, metoda încearcă să păstreze geometria tridimensională a moleculelor în timpul expansiunii. Dacă viitoarele cercetări vor confirma că această abordare poate funcționa eficient în celule și țesuturi intacte, ea ar putea deschide o nouă etapă în studiul proteinelor.
În cele din urmă, ideea este remarcabil de simplă: când nu putem face microscopul suficient de puternic, putem face lumea microscopică suficient de mare. Un hidrogel capabil să mărească probele biologice de un miliard de ori ca volum ar putea transforma această idee într-un instrument important al biologiei moleculare de mâine.
Sursa: Harvard Science in the News