Testul imunosorbant legat de enzimă (ELISA) este un test imunologic utilizat în mod obișnuit pentru a măsura anticorpii, antigenele, proteinele și glicoproteinele din probele biologice. Câteva exemple includ: diagnosticul infecției cu HIV, teste de sarcină și măsurarea citokinelor sau a receptorilor solubili din supernatantul celular sau din ser.
Testele ELISA sunt, în general, efectuate pe plăci cu 96 de godeuri, permițând măsurarea mai multor probe într-un singur test. Aceste plăci trebuie să fie plăci absorbante speciale (de exemplu, plăci NUNC Immuno) pentru a se asigura că anticorpul sau antigenul se lipește de suprafață. Fiecare test ELISA măsoară un antigen specific, iar pe piață sunt disponibile truse pentru o varietate de antigene.
Testul ELISA din Figura 1 este ceea ce este cunoscut sub numele de ELISA sandwich; aici sunt utilizate două seturi de anticorpi pentru a detecta produsele secretate, de exemplu citokinele. Metoda se derulează în mai multe etape. Prima etapă este acoperirea plăcii ELISA cu anticorp de captură, orice exces de anticorp nelegat fiind apoi spălat de pe placă. Anticorpul specific este un anticorp anume produs împotriva antigenului de interes.
Figura 1 – Testul ELISA sandwich, cu cele patru etape ale analizei.
Apoi se adaugă proba (de exemplu, urină, ser sau supernatant celular). Orice antigen găsit în probă se va lega de anticorpul de captură care acoperă deja placa. Probele sunt adăugate de obicei în duplicat sau în trei exemplare (pentru a permite analiza statistică) și în concentrații diferite pentru a garanta că se încadrează în nivelurile de detecție ale testului. Din nou, orice probă în exces este spălată de pe placă.
În etapa 3, se adaugă anticorpul de detectare. Acest anticorp este marcat cu o enzimă, de obicei peroxidază de hrean sau fosfatază alcalină. Anticorpul de detectare se leagă de orice antigen țintă deja legat de placă. În cele din urmă, se adaugă un substrat pe placă. Testele ELISA sunt, de obicei, cromogene, folosind o reacție care transformă substratul (de exemplu, TMB sau ABTS) într-un produs colorat care poate fi măsurat folosind un cititor de plăci.
Determinarea concentrației de antigen într-o probă necesită producerea unei curbe standard, utilizând antigeni cu o concentrație cunoscută (prezentată în Figura 2). Concentrația de antigen dintr-o probă poate fi apoi calculată utilizând densitatea optică (DO).
Figura 2 – Curbă standard ELISA IFN-y. Pentru a determina concentrația de antigen dintr-o probă, trebuie pregătită o curbă standard folosind o soluție de concentrație cunoscută.